高效液相色谱—串联质谱法测定阿托伐他汀的血药浓度_药学专业毕业论文
发布时间：2014-11-09
来源：人大经济论坛
【摘要】目的 建立高效液相色谱串联质谱法测定阿托伐他汀血药浓度的方法。方法 采用纯乙腈超声提取，高速离心沉淀蛋白后，以乙腈-乙酸铵缓冲液作为流动相，Phenomenex Luna 3μ C18(2) 100 A (150×2.00mm 3μm)反相色谱柱，在正离子模式下以电喷雾电离串联质谱进行测定。结果 血浆中阿托伐他汀的线性范围为0.1-20 ng/mL，定量限为 0.1 ng/mL。方法回收率为 96%～103%，日间 、日内RSD 均小于6%。 结论 本方法简单、灵敏、准确，适用于阿托伐他汀人体血药浓度的检测。
【关键词】阿托伐他汀 血药浓度 高效液相色谱串联质谱法(LC-MS/MS)
阿托伐他汀钙片是他汀类血脂调节药，为3-羟基-3-甲基一戊二酰辅酶A(HMG-CoA)还原酶抑制剂[1]，它能够降低血浆胆固醇和脂蛋白水平，减少低密度脂蛋白的生成，临床上用于家族性高胆固醇血症、混合性高脂血症等症。因其降脂作用强，副作用小，在高脂血症，特别是高胆固醇血症的治疗中得到广泛应用 [2]。本文建立了高效液相色谱串联质谱法测定血浆样品中的阿托伐他汀，本法专灵敏度高、重现性好，样品处理方法简便。化学结构见图1。
图1 阿托伐他汀的结构式
Fig.1 Structure of Atorvastatin
1 实验部分
1.1材料和试剂
阿托伐他汀标准品购自中国药品生物制品检定所;前处理所用乙腈为分析纯，流动相的乙腈为色谱纯(德国 MERCK);实验用水为超纯水，由 Milli-Q系统制作(美国Millipore公司)。
1.2液相色谱条件
液相色谱仪器为岛津Prominence UFLC;色谱柱选用 Phenomenex Luna 3μ C18(2) 100 A (150×2.00mm 3μm);柱温40℃;流动相：乙腈乙酸铵缓冲液(乙酸铵5mmol/L、甲酸0.5%(v/v))(体积比6：4)，等度洗脱;进样量10μL;流速保持在0.3mL/min。
1.3质谱条件
质谱仪器为美国AB公司的API4000 Q-trap;电离方式：ESI(+);选择多重反应监(MRM);电离电压5500V，辅助加热温度500℃，气帘气30psi，雾化气3psi，碰撞气：中等，离子源气体1：50psi，离子源气体2：60psi。阿托他汀在ESI(+)[M+H]+ 的MRM 模式下的质谱参数见表1。
1.4血浆样品处理
精确量取血浆样品0.5mL于10mL离心管中，准确加入2.5mL乙腈，涡旋2min后，超声10min，在 4500r/min转速下离心5min。移取上清液用氮气吹干，用1mL的50%乙腈水定容 ，过0.22μm滤膜 ，供LC-MS-MS分析。
表1 阿托伐他汀在ESI(+)[M+H]+ 的MRM模式下的质谱参数
Table 1 Test parameters for Atorvastatin in MRM
*定量离子对(quantitative ion pair)
2 结果与讨论
2.1方法的线性范围、 相关性及检出限实验
以在血浆空白样品基体中六点添加标准品法制作校正曲线, 7点添加水平分别是0.1ng/mL、0.2ng/mL、0.5ng/mL、1ng/mL、5ng /mL、10ng/mL、20ng/mL。按本文方法进行加标回收试验，结果表明，方法此范围内线性相关，相关系数r=0.9998，当信噪比S /N≥10时，定量下限LOQ为0.1 ng/mL。
2.2方法的精密度和回收率
取空白血浆，分别精确加入适量的阿托伐他汀标准溶液，配制成浓度为0.2 ng/mL、2 ng/mL.10 ng/mL的血浆样品各6份，按1.4步骤处理在同日内重复测定5次，并连续5天测定，计算日内、日间的精密度。得到的日内精密度(RSD%)分别为2.62、3.11、1.97，日间精密度分别为3.55、 5.65、4.98。阿托伐他汀0.2 ng/mL、2 ng/mL、10 ng/mL三个水平浓度的测定回收率结果见表2。
表2 空白血浆阿托伐他汀的添加回收率和精密度(n=6)
Table 2 Recoveries and precisions of Atorvastatin at different fortified levels (n=6)
2.3稳定性试验
取空白血浆.精确加入适量的阿托伐他汀标准溶液，分别配制成浓度为0.5ng/mL和2 ng/mL血浆溶液，按1.4项下血浆处理方法操作，分别于 0、2、4、8、10h时进行色谱分析，记录峰面积。结果，RSD分别为3.56%和4.14%。表明样品血浆溶液在10h内稳定。
图2阿托伐他汀在MRM条件下二种离子的谱图
Fig.2 Two ion chromatograms of Atorvastatin in MRM
2.4实验条件的优化讨论
试验中比较了甲醇乙酸铵缓冲液、乙腈乙酸铵缓冲液、甲醇水和乙腈水[3-6]四种流动相体系，结果表明，以乙腈乙酸铵缓冲液作为流动相得到的峰型最好，出峰时间也较稳定。这可能由于水相中甲酸提高了待测物在ESI正离子电喷雾中的离子化效率，乙酸铵则使检测物出峰时间较为稳定。因此本文选择用乙腈 乙酸铵缓冲液作为流动相，得到的谱图峰形的对称、出峰时间和灵敏度均较理想(见图2)。
参 考 文 献
[1]赵冰.阿托伐他汀的临床研究进展[J]. 中国药房，2010,21(24):203-204.
[2]Plosker GL，Wagstaf AJ.Fluvastatin：a review of its pharmaeology and use in the management og hypereholesterolaemia[J].Drugs, 1996, 51:433.
[3]姜楠，杨永革，许雪廷，等. LC-MS-MS法测定人血浆中阿托伐他汀浓度[J]. 药学实践杂志 2 0 1 1, 2 9(1):15-17.
[4]胡晓玲，李环德.UPLC-MS/MS法测定健康人血浆中的阿托伐他汀浓度及药物代谢动力学研究[J]. 中南药学，2008，6 (4)：400.
[5]Tatar S, Atma ca S.Determination of amlodipine in human plasma by high performance liqued chromatography with fluorescence detection [J].J Chromatogr B Biomed Sci Appl,2001,758(2):305-310.
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