一种新型海洋来源的蒽环类化合物D19抗肿瘤活性及机制研究_药学专业毕业论文范文
发布时间：2014-12-09
来源：人大经济论坛
一种新型海洋来源的蒽环类化合物D19抗肿瘤活性及机制研究_药学专业毕业论文范文
【摘要】 目的探讨新型海洋源性蒽环类化合物D19的抗肿瘤作用及分子机制。方法 采用四甲基二氮唑蓝(MTT)比色法、脱氧核糖核酸末端转移酶介导的缺口末端标记法(TUNEL)、免疫印迹法(Western Blotting)检测D19对人乳腺癌细胞系MCF-7和MDA-MB-435生长的影响及相关信号通路蛋白的变化。结果 D19对MCF-7、MDA-MB-435的半数抑制浓度(IC50)分别为4.01 μmol/L和7.32 μmol/L;D19具有有效诱导人乳腺癌细胞凋亡的作用;Western Blotting结果显示D19作用后细胞中的凋亡蛋白如caspase 9以及下游的效应蛋白PARP都发生裂解。结论 从细胞水平和分子水平证明新型海洋源性蒽环类化合物D19具有很强的抗乳腺癌活性，有可能发展成为治疗乳腺癌等其他实体肿瘤的先导化合物。
【关键词】 海洋共生微生物;抗肿瘤;蒽环类化合物;人乳腺癌细胞;凋亡
Abstract:ObjectiveTo study the antineoplastic activity and mechanism of D19,a novel anthracycline derived from marine commensal microorganisms at both cellular level and molecular level. Methods The inhibitory effects of D19 on growth of breast cancer cell lines were determined by MTT assay. The molecular signaling pathways of apoptosis were measured by terminal deoxynucleotidyl transferase (TDT)-mediated biotinylated deoxyuridine-triphosphate (dUTP)-biotin nick end labeling (TUNEL) staining and western blotting. Results IC50 of D19 on MCF-7 and MDA-MB-435 cell lines were 4.01 μmol/L and 7.32 μmol/L respectively. TUNEL staining showed that D19 could induce apoptosis in MCF-7 cells. In addition,Western blot detected some apoptosis proteins such as caspase 9 and PARP being cleaved after treatment with D19. Conclusion These results suggested that D19 might be used as a promising chemotherapeutical agent for patients with breast cancer and other solid cancer.
Key words:marine commensal microorganism;antineoplastic;anthracycline;human breast cancer cells;apoptosis
长期以来，恶性肿瘤一直严重威胁着人类健康与生命。据世界卫生组织统计，全世界每年约有600万人被癌症夺去生命，估计到2020年将升至1 000万人[1]。其中乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，而且是实体瘤中应用化疗最有效的肿瘤之一。因此寻找有效的抗肿瘤化合物对于乳腺癌的治疗具有重要的意义。蒽环类化疗药物是目前临床应用广泛的抗肿瘤一线化疗药物，尤其是乳腺癌化疗中最常用的药物，但是此类药物仍存在骨髓抑制性、心脏毒性问题，以及肿瘤患者长期使用出现的多耐药现象，大大限制了其剂量提高和临床治疗效果[2-4]。因此，有必要寻找更好的同类化疗替代药物[5]。本文从分子水平和细胞水平对海洋微生物来源的蒽环类化合物D19抗人乳腺癌作用进行了研究，为该化合物最终成为抗肿瘤药物提供理论依据，并为进一步开发高效低毒的抗肿瘤新型候选药物奠定基础。
1材料与药物
人乳腺癌细胞系MDA-MB-435、MCF-7为本实验室保存，并已在本实验室已发表的其他研究项目中使用[6]。D19由中山大学化学与化学工程学院林永成教授提供[7]。各种化合物由二甲基亚砜(DMSO)(Sigma公司)制备保存母液。
2方法
2.1细胞培养
人乳腺癌细胞系MCF-7、MDA-MB-435培养于含5%(φ)胎牛血清(Hyclone公司)、2 mmol/L L-谷氨酰胺、 0.1 mmol/L非必需氨基酸、 10 mmol/L Hepes(缓冲液)、100 IU/mL青霉素和100 μg/mL链霉素的DMEM完全培养基中(以上细胞培养相关试剂均为Invitrogen/Gibco公司产品，购自Invitrogen公司)，置于37 ℃ 5%(φ) CO2孵箱中孵育培养。传代时用含0.02%EDTA的0.05%(φ)胰酶消化，以DMEM完全培养基终止消化。
2.2四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色实验
将MCF-7和MDA-MB-435细胞消化后计数，按每孔1.0×104个细胞分别接种至96 孔细胞培养板中，置于37 ℃ 5%CO2孵箱中孵育培养。24 h后更换为含浓度依次为0、0.001、0.05、0.1、0.5、1、2、3、4 μmol/L D19的培养基，每个浓度均设3个平行复孔，继续培养48 h后，显微镜下观察细胞形态及生长的变化。随后每孔加入质量浓度为5 mg/mL MTT(Genview公司，用1×磷酸盐缓冲液溶解，终质量浓度5 mg/mL，过滤除菌，分装后-20 ℃避光保存)溶液20 μL，37 ℃作用4 h，离心后弃上清液，加入DMSO 150 μL，振荡器振荡10 min充分溶解结晶，置酶标仪上测定波长为490 nm下的吸光度A值，按以下公式计算抑制率。细胞生长抑制率(%)=(对照组平均A值-实验组平均A值)/对照组平均A值×100 %。对照组即D19浓度为0的培养孔。使用半数抑制浓度(IC50)计算软件Bliss’s software 计算IC50，应用SPSS软件行数据统计分析。
2.3脱氧核糖核酸末端转移酶介导的缺口末端标记法(TUNEL)染色
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