发布时间：2014-12-09 来源：人大经济论坛

诃子提取物及含药血清对大鼠肝细胞损伤保护作用的研究_药学专业毕业论文    【摘要】  目的观察诃子提取物以及含药血清对CCl4引起大鼠肝细胞损伤保护作用，以及保肝作用机理的初步探讨。方法采用Ⅳ型胶原酶灌流法分离大鼠肝细胞进行原代培养，体外采用CCl4(20mmol/L)诱导肝细胞损伤，采用光镜观察、MTT法以及MDA检测，观察诃子提取物以及含药血清的保肝作用，并通过检测相应的抗氧化酶活性对保肝作用进行初步研究。结果诃子提取物及含药血清具有显著的保肝作用，诃子提取物(0.8，1 mg/L)和0.9 g/kg所制备的含药血清能够改善CCl4所引起的细胞形态变化，显著提高细胞活力，能够有效抑制CCl4引起的肝细胞脂质过氧化作用，并提高脂质过氧化酶SOD 和GSH-Px的活性。结论诃子提取物及其含药血清具有保肝作用，这种作用与提高抗氧化酶的活性有关。    【关键词】  诃子; 肝损伤; 抗氧化    诃子为常用的中药之一，收载于《中国药典》[1]。诃子是使君子科植物诃子Terminalia chebula Retz或绒毛诃子Tchebulm Retz var tomentella Kurt的干燥成熟果实，生产于印度及斯里兰卡，我国云南亦有生产。诃子具有涩肠止泻敛肺，降火利咽的功效。诃子的主成分为诃子酸(chebulinic acid)、诃黎勒酸(chebulagicacid)、1, 3, 6-三没食子酰葡萄糖等[2]。近期报道有三帖类、多元酚酸类、脂肪族化合物以及氨基酸、矿物质等成分[3]。对诃子药理作用研究发现诃子具有抗菌、强心、抗氧化以及解痉等作用[4]，另有文献报道含有诃子的复方具有明显的抗肿瘤及抗艾滋病毒活性[5，6]。关于诃子保肝作用的研究，本研究室在先前的动物实验中已有报道[7]。本文采用体外分离大鼠肝细胞进行肝细胞原代培养，用CCl4诱导肝细胞损伤模型，观察诃子提取物(extract of Terminalia chebula Retz，ET )对肝细胞损伤保护作用以及作用机理的初步研究，并为进一步发现活性组分确定体外筛选技术。 1 材料与仪器 1.1 药物诃子购自内蒙古凯蒙大药房，经内蒙古医学院药学院植化教研室庞秀生教授鉴定为使君子科植物诃子Terminalia chebula Retz的干燥成熟果实。 1.2 试剂MTT、Ⅳ型胶原酶购自SIGMA公司，RPMI-1640购自GIBCO公司，CCl4天津市化学试剂三厂生产，GOT购自中生北控生物科技股份有限公司，MDA、SOD、GSH-Px试剂盒购自南京建成生物工程研究所。其它试剂均为市售分析纯。 1.3 动物清洁级Wistar大鼠，体质量(200±20)g，购自内蒙古大学实验动物中心(动物号YXQ(蒙)2002-0001)。 1.4 仪器SCOTT-Ⅱ半自动生化分析仪(意大利MENARINI公司)，721型紫外分光光度计(上海第三分析仪器厂)，高速冷冻离心机(长沙湘仪离心机厂)，MODEL680型酶联免疫检测仪(Bio-Bad LABORATIES,INC)。 2 方法 2.1 诃子提取物的制备100g鞣质经3次丙酮提取后(55℃加热回流提取)，弃去残渣，收集合并3次滤液 ，加入等体积的乙醚除杂质，弃去醚层，收集水层，用等体积的醋酸乙酯萃取5~6次，收集醋酸乙酯层，回收醋酸乙酯，在55 ℃水浴蒸干得黄色粉末，研磨备用。 2.2 诃子含药血清制备大鼠实验前禁食12 h，大鼠20只分为5组，雌雄各半，实验前禁食12 h。空白组每天灌服蒸馏水(2 m1/kg)、诃子含药血清4个不同给药组(剂量分别为0.06，0.3，0.6，0.9g/kg),各组每天给药2次，连续灌服3 d并在最后1次灌胃后2 h,腹腔注射戊巴比妥钠麻醉，行腹主动脉无菌采血凝固后，低温离心分离血清，将各组4只大鼠血清混合，置-20℃冰箱保存备用[8]。 2.3 大鼠肝实质细胞原代培养取Wistar大鼠1只、体质量(200±20)g雌雄不限、先腹腔注射4%戊巴比妥钠50mg/kg麻醉，皮毛消毒后，背位固定在解剖板上，在无菌条件下打开腹腔分离肝脏，找到门静脉和下腔静脉并尽量与周围组织剥离干净，在门静脉近心、远心端以及下腔静脉各穿一根灭菌手术线后，结扎门静脉远心端和下腔静脉手术线，做门静脉插管。先以37 ℃的灌流液以蠕动泵恒速在位灌流，待肝脏肿胀变大后，迅速剪断下腔静脉结扎线的远心端以使灌流液顺畅流出，待预灌流液结束后,更换为Ⅳ型胶原酶灌流液，继续做在位灌流，灌流结束后剪断肝脏与周围组织的连接，将肝脏移至玻璃平皿中用不完全1640培养液清洗，之后小心撕开肝脏包膜轻轻振摇抖落肝细胞成肝细胞悬液。收集悬液于锥形瓶中，37 ℃振荡培养 15min，培养结束后立即置冰水中冷却，100目不锈钢钢网过滤，收集滤液在4℃条件下800 r/min离心 3 min，弃上清，用清洗液按照上述条件清洗离心3次，末次弃上清后，以培养液重悬制成 1×106个/ml肝细胞悬液，用台盼蓝染色，当肝细胞活力大于 85%时用于实验[9]。 2.4 CCl4致肝细胞损伤模型的建立肝细胞培养36h后，