蛋白原核表达Protocol

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提取原核表达蛋白
Protocol
李卫红2016-7
预实验：
Rosseta
菌，37℃试管摇菌，过夜；
第二天将菌液全部加入到
100mlLB
中（载体抗性：氯霉素，
kana
），37℃摇菌（约
1-2小时后）测
OD值：0.6-0.8
；取1ml做诱导前对照，四度保存（跑蛋白胶前直接取样加
loading buffer
）；加入一定体积
0.1M IPTG
（终浓度为
0.1mM
）；（也可设计一系列浓度梯度和处理时间，寻找最适浓度和时间）（它的作用：使操纵子从阻遏状态激活）
将菌液放入
18℃-20℃诱导10-16
小时；（温度过高，上清无蛋白包涵体）
菌液用50ml
离心管进行离心，
8000rpm
，10min
，4℃；用lysis buffer
悬起菌，建议先加入
1ml菌液，再定到
2ml；加入2微升溶菌酶（
100mg/ml
），冰上放置
30min
；超声破碎
2-3s,2s,25-30min
（工作，间隙，时长）；
12000rpm
，15min
，收集上清，做诱导后上清对照；
沉淀用600微升SDS（10%）悬起（速度要快）；
95℃煮至透明（
10min
...

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