泛素化蛋白质组

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一、叶片总蛋白的提取消化
1、取2 g叶片，在研钵中加入液氮充分研磨，然后转到离心管中，加入
30 ml
预冷的含有
10% TCA
和0.07% DTT
的丙酮，充分混匀后在
-20°C沉淀过夜。
2、4°C，35000 g
离心1 h后，弃上清。加入
30 ml
预冷的含有
0.07% DTT
的丙酮，充分混匀后置于
-20°C中1h。4°C，35000 g
离心1 h，弃上清。
3、用30 ml
预冷的含有
0.07% DTT
的丙酮洗涤沉淀
2次，最后打开管盖风干，尽量使残留的丙酮挥发干净。
4、取适量裂解液
(20Mm HEPES pH8.0
，8M Urea
，2.5mM
焦磷酸钠，
1mMβ-甘油磷酸盐，
50uM PR-169)
溶解蛋白粉末。
5、25000 g
，4°C离心30 min
后，收集上清，即为蛋白，如上清含有杂质可再离心一次，定量测定蛋白含量后置于
-80°C或进行下一步操作。本实验采用考马斯亮蓝法
(Bradford
法)测定蛋白质浓度，用
BSA作为标准液，在
96孔板中加入相应的
BSA标准蛋白以及考马斯亮蓝试剂。
按顺序将上述标准蛋白加入
96孔 ...

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关键词：蛋白质 Bradford urea BRAD Ford