发布时间：2014-11-12 来源：人大经济论坛

【关键词】  海洋放线菌；,次级代谢产物；,异黄酮；,环二肽；,抗肿瘤活性 摘要： 一株来源于海泥的放线菌S1001发酵产物具有致细胞坏死活性，本文采用溶剂萃取、硅胶柱层析及制备HPLC等分离手段对该菌株发酵产物的活性部位进行了活性追踪分离，共分离得到8个化合物，通过理化性质及波谱学手段，鉴定其结构分别为4′，5，7三羟基异黄酮(1)，4(2，4二羟基苯酰胺基)苯甲酸(2)，环(甘氨酸丙氨酸)(3)，环(甘氨酸脯氨酸)(4)，环(亮氨酸酪氨酸)(5)，环(缬氨酸亮氨酸)(6)，环(缬氨酸异亮氨酸)(7)，环(苯丙氨酸甘氨酸)(8)。并用SRB法初步评价了化合物1～8的抗肿瘤活性，结果表明化合物4、5和7在10μmol/L浓度时对K562细胞表现出了一定的抑制活性。 关键词： 海洋放线菌； 次级代谢产物； 异黄酮； 环二肽； 抗肿瘤活性     The antitumor active component from marine derived actinomycete S1001  　　KEY WORDS Marine actinomycete; Secondary metabolites; Isoflavone; Cyclodipeptides; Antitumor activity    海洋微生物由于生活在高盐、高压及寡营养的特殊中，具有独特的代谢方式，因此能产生许多结构新颖、活性独特的次级代谢产物。近20年来，有关海洋微生物产生新的活性次级代谢产物的报道逐渐增多，海洋微生物作为活性物质的新来源正日益被国内外海洋研究工作者重视。本实验室以小鼠乳腺癌tsFT210细胞为活性筛选模型，对我国青岛沿海采集的海泥样品中分离纯化的微生物菌株进行筛选［1］，得到一株放线菌S1001具有坏死性细胞毒作用。为阐明它的抗肿瘤活性成分，采用活性追踪的方法，对其发酵物进行研究，迄今为止，共分离得到9个化合物，利用理化性质和波谱学方法鉴定了其中8个化合物。本文着重报道化合物1～8的提取分离，结构鉴定及活性研究。     1 与方法     1.1 试验试剂和仪器熔点用日本Yanaco公司MP500D型显微熔点仪测定(未校正)；质谱用QTOF ULTIMA GLOBAL GAA076 LC型质谱仪，核磁共振谱用日本JEOL JNMECP600型核磁共振仪测定；制备用高效液相色谱仪采用日本岛津公司产品［LC6AD泵，SPDM20AVP检测器，SCL10AV型系统控制器，Shinpak C18柱(20mm×250mm，5μm)，4ml/min］；Sephadex LH20和层析用硅胶H(10～40μm)分别为Pharmacia公司和青岛海洋化工厂产品；活性测试采用小鼠温敏型乳腺癌tsFT210细胞；胎牛血清(FBS)和RPMI1640细胞培养基分别为Hyclone公司(Cat.No.STF721)和GIBCOBRL公司产品。磺酰罗丹明B(SRB)为Sigma公司产品。     1.2 菌株的分离与培养     1.2.1 产生菌株 放线菌S1001从青岛沿海的海泥中分离得到，其发酵液的总提物对小鼠乳腺癌tsFT210细胞表现出坏死性细胞毒活性。     1.2.2 培养 从28℃培养4d的高氏1号培养基上取适量菌体，接种于种子培养基(葡萄糖2%，可溶性淀粉1%，豆粉0.5%，蛋白胨2%，酵母提取物0.4%，牛肉膏0.1%，K2HPO4 0.05%，CaCO3 0.2%，陈海水配制，pH值调至7.0)，于28℃，120r/min的条件下摇床培养2d得到种子培养液。将该种子培养液按10%的接种量，接种于150瓶每瓶含100ml液体培养基(成分同上)的500ml三角瓶中，28℃，120r/min摇床培养5d，发酵15L。     1.3 活性测试     1.3.1生物活性测试方法 按照文献［2，3］采用SRB(sulforhodamine B，磺酰罗丹明B)法，结合显微镜观察细胞形态变化(顺铂做阳性对照)。     1.3.2有效部位的确定 取发酵液1ml，减压浓缩蒸干，然后溶于甲醇，该甲醇提取物在1mg/ml的浓度下，显示了强的坏死性细胞毒抗肿瘤活性。将甲醇提取物配制成10mg/ml的蒸馏水混悬液，取混悬液三份分别加入等体积的乙酸乙酯和正丁醇萃取并测试活性。结果表明，只有乙酸乙酯萃取物具有与粗提物相应的生物活性，故确定为有效部位。1.4 提取分离培养物用滤纸抽滤，分为上清液和菌丝体两部分。上清液15L浓缩至约5L，等体积乙酸乙酯萃取三次；菌丝体先用80%丙酮提取，提取液浓缩至无丙酮后所得的水相再用等体积乙酸乙酸萃取三次，合并两部分的乙酸乙酯萃取物得总浸膏2.6g。浸膏拌硅胶过柱，以石油醚∶丙酮、氯仿∶甲醇梯度洗脱，收集各馏分，减压浓缩、合并，得到9个色谱组份Fr1～Fr6。每个组分经活性测试，确定Fr3、Fr4和Fr6为活性组分。经反复的正反相硅胶、Sephadex LH20柱色谱和高效制备液相色谱等分离手段，从Fr3得到化合物2(4mg)、6(11mg)，从Fr4得化合物1(5mg)、5(13mg)、7(9mg)，从Fr6得化合物3(28mg)、4(18mg)、8(10mg)。     2 结果与讨论     2.1 化合物结构鉴定化合物1 无色针晶，ESIMS(Negative)：m/z 269［MH］-。1HNMR(600MHz，CD3OD)δ：8.04(1H，s，H2)，735(2H，d，J=86Hz，H2′，6′)，682(2H，d，J=86Hz，H3′，5′)，632(1H，d，J=22Hz，H8)，620(1H，d，J=22Hz，H6)；13CNMR(150MHz，CD3OD)δ：1822(s，C4)，1659(s，C7)，1638(s，C5)，1597(s，C9)，1588(s，C4′)，1548(d，C2)，1313(d，C2′，6′)，1247(s，C1′)，1233(s，C3)，1162(d，C3′，5′)，1062(s，C10)，1001(d，C6)，947(d，C8)，参照文献［4］确定结构为4′，5，7三羟基异黄酮(4′，5，7trihydroxyisoflavone)。化合物2 无色针晶，ESIMS(Positive)：m/z 274 ［M+H］+。1HNMR(600MHz，C6D5Nd5)δ：805(1H，d，J=86Hz，H6)，736(2H，dt，J=66，22Hz，H2′，6′)，693(1H，dd，J=86，22Hz，H5)，685(1H，d，J=22Hz，H3)，684(2H，dt，J=66，22Hz，H3′，5′)，结构鉴定为4(2，4二羟基苯甲酰胺基)苯甲酸［5］［4(2，4dihydroxybenzamido)benzoic acid］。化合物3 白色粉末，1HNMR(600MHz，CD3OD)δ：400(1H，brq，J=69Hz，H6)，391(2H，dd，J=47，11Hz，H3)，142(3H，d，J=69Hz，CH37)；13CNMR(150MHz，CD3OD)δ：1716(s，C1)，1687(s，C4)，517(d，C6)，454(t，C3)，194(q，C7)，参照文献［6］确定结构为环(甘氨酸丙氨酸)［cyclo(GlyAla)］。化合物4 无色片状结晶，1HNMR(600MHz，CD3OD)δ：423(1H，brt， J=82Hz， H9)， 409(1H，d，J=179Hz，H3a)，372(1H，d，J=179Hz，H3b)，348～357(2H，m，H6)，229～233(1H，m，H8a)，200～204(1H，m，H8b)，190～198(2H，m，H7)，确定结构为环(甘氨酸脯氨酸)［cyclo(GlyPro)］。化合物5 无色针晶，1HNMR(600MHz，DMSOd6)δ：690(2H，d，J=84Hz，H2′，6′)，664(2H，d，J=84Hz，H3′，5′)，406(1H，m，H3)，344(1H，m，H6)，301(1H，dd，J=136，32Hz，H11a)，269(1H，dd，J=136，48Hz，H11b)，142(1H，m，H8)，075(1H，m，H7a)，012(1H，m，H7b)，064(3H，d，J=66Hz，CH39)，064(3H，d，J=66Hz，CH310)；13CNMR(150MHz，DMSOd6)δ：1674(s，C4)，1662(s，C1)，1564(s，C4′)，1312(d，C2′，6′)，1259(s，C1′)，1149(d，C3′，5′)，557(d，C6)，522(d，C3)，437(t，C11)，377(t，C7)，229(s，C8)，228(q，C9)，213(q，C10)，参照文献［7］确定结构为环(亮氨酸酪氨酸)［cyclo(LeuTyr)］。化合物6 无色针晶，1HNMR(600MHz，CD3OD)δ：397(1H，brt，J=68Hz，H6)，381(1H，d，J=37Hz，H3)，230(1H，m，H11)，184(1H，m，H8)，166～175(2H，m，H7)，104(3H，d，J=73Hz，CH312)，094(9H，d，J=66Hz，CH39，10，13)；13CNMR(150MHz，CD3OD)δ：1716(s，C1)，1702(s，C4)，612(d，C3)，542(d，C6)，431(t，C7)，336(d，C11)，252(d，C8)，233(q，C9)，225(q，C10)，188(q，C12)，169(q，C13)，结合文献［8］确定结构为环(缬氨酸亮氨酸)［cyclo(ValLeu)］。化合物7 无色针晶，1HNMR(600MHz，CD3OD)δ：393(1H，dd，J=94，47Hz，H6)，376(1H