转录组分析实战：GO与KEGG富集分析原理及R语言实现

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1. 富集分析基础概述

1.1 富集分析的定义与意义

富集分析（Enrichment Analysis）是生物信息学中的核心分析手段之一，主要用于判断在特定分子集合（如差异表达基因、蛋白质或代谢物）中，某些功能类别或生物学通路是否出现显著聚集现象。该方法广泛应用于转录组、蛋白质组及代谢组等高通量数据分析中，有助于揭示潜在的生物学机制、疾病相关通路以及基因功能注释。

其主要目标在于评估一组选定的生物分子（例如实验中筛选出的差异基因）是否在某个已知的功能集合中非随机地集中出现。举例来说，在研究某种癌症的基因表达谱时，若发现大量差异基因集中于某一信号通路，则通过富集分析可识别该通路是否具有统计学上的显著性，从而提示其可能参与疾病的调控过程。

1.2 常见的富集分析类型

目前主流的富集分析方法包括以下几类：

• GO富集分析：基于Gene Ontology数据库，从三个维度系统描述基因功能：
  • 分子功能（Molecular Function, MF）——指基因产物在分子层面执行的具体活性，如酶催化或结合能力；
  • 细胞组分（Cellular Component, CC）——表示基因产物在细胞内的定位区域，如线粒体、细胞核等；
  • 生物过程（Biological Process, BP）——反映基因所参与的完整生物学活动，如细胞周期、免疫应答等。
  例如，若一组基因显著富集于GO:0006954（炎症反应），则表明这些基因可能在机体的免疫和炎症调节中发挥重要作用。

• KEGG富集分析：依托京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）数据库，对目标基因集进行通路注释和统计检验，识别其显著关联的代谢或信号传导通路，帮助理解基因在系统层面的功能角色。

• GSEA富集分析
• GSVA富集分析

本部分内容将重点介绍GO与KEGG两类富集分析的基本原理及其实际应用。GSEA和GSVA等相关方法将在后续章节中进一步展开说明。

1.3 如何解读富集分析结果

（1）GO富集分析结果解析

在GO富集结果表格中，各字段含义如下：

• ONTOLOGY：标明该条目所属的GO分类，即BP（生物过程）、MF（分子功能）或CC（细胞组分）。
• ID：GO通路的唯一编号，用于在数据库中精确检索对应条目，类似于“身份证号”。
• Description：对该GO条目的简要功能描述，便于快速理解其生物学意义。
• GeneRatio：表示富集到该通路的基因数与输入总基因数的比例，体现该通路在目标基因集中的覆盖程度。
• BgRatio：背景基因集中与该通路相关的基因占比，用于对比目标集与全基因组之间的分布差异。
• Pvalue：原始p值，衡量富集显著性的指标，数值越小表示越显著，通常以<0.05为阈值判断显著性。
• p.adjust：经过多重假设检验校正后的p值（常用Benjamini-Hochberg法），控制假阳性率，提供更严谨的显著性评估。
• Qvalue：即q值，用于估计假发现率（FDR），值越低说明富集结果越可靠。
• geneID：列出所有富集至该通路的基因ID，以斜杠分隔，可用于后续验证或网络构建。
• Count：实际映射到该通路上的基因数量，反映该通路被激活或影响的程度。

（2）KEGG富集分析结果解读

KEGG分析结果通常包含以下列信息：

• Category：通路所属的大类划分，如“Metabolism”（代谢）、“Genetic Information Processing”（遗传信息处理）或“Human Diseases”（人类疾病），便于宏观把握功能方向。
• Subcategory：子分类层级，进一步细化通路归属，例如在“Human Diseases”下可细分为“Neurodegenerative disease”（神经退行性疾病）等。
• ID：KEGG通路的唯一标识符，可在KEGG官网中直接查询详细通路图谱。
• Description：对通路功能的文字描述，帮助用户快速了解其生物学背景。
• GeneRatio：目标基因集中富集于该通路的基因比例，体现该通路在研究集合中的相对重要性。
• BgRatio：在整个参考基因组中，属于该通路的基因所占比例，作为比较基准。

Pvalue：表示常规的 p 值，用于评估基因富集结果的统计显著性。p 值越低，说明该通路或功能类别的富集越显著。一般认为当 p 值小于 0.05 时，富集具有统计学意义。

p.adjust：为经过多重假设检验校正后的 p 值，常采用 Benjamini-Hochberg 方法进行计算，目的是控制整体的假阳性率。相比原始 p 值，校正后的 p 值在判断显著性时更为严格，能更可靠地反映真实富集情况。

Qvalue：即 q 值，是基于假发现率（False Discovery Rate, FDR）校正后的一种显著性指标，本质上也反映了校正后的显著性水平。q 值越小，表明富集结果中出现假阳性的可能性越低，富集越可信。

geneID：列出的是参与该通路或功能类别富集分析的基因标识符（Gene ID），各基因间以斜杠分隔。这些基因可用于后续的功能验证、网络构建或其他生物信息学分析。

Count：指在当前通路中被富集到的基因数量，直观体现有多少差异表达基因参与到该生物学过程或信号通路中。

2. GO 与 KEGG 富集分析

2.1 GO 富集分析

本部分将基于《转录组基因表达差异分析全流程：以GSE65682为例》一文中获得的差异表达基因结果，开展 GO 功能富集分析。

library(clusterProfiler)
library(org.Hs.eg.db)
导入要富集分析的基因
# 读取基因数据文件，文件中包含基因符号（gene symbols）
gene_data <- read.csv("D:\\Users\\Desktop\\转录组\\DEGhc_Sepsis.csv") ?
# 提取基因符号列，并将其转换为字符向量
gene_vector <- as.character(gene_data[[1]]) ?# 将第一列基因符号列转换为字符向量
将基因符号转换为Entrez ID
# 使用bitr函数将基因符号转换为Entrez ID
# fromType = "SYMBOL" 表示输入的基因标识符是基因符号
# toType = "ENTREZID" 表示目标标识符是Entrez ID
# OrgDb = "org.Hs.eg.db" 指定使用人类基因注释数据库
entrez_ids <- bitr(gene_vector, fromType = "SYMBOL", toType = "ENTREZID", OrgDb = "org.Hs.eg.db")

如下图所示为 entrez_ids 的转换结果，其中第一列为基因符号（symbol），第二列为对应的 ENTREZID 编号。

需要注意的是，在使用 bitr 函数进行基因 ID 转换时，部分基因可能无法匹配到相应的 ENTREZID，这种情况属于正常现象，主要由于数据库注释不完整或基因命名差异所致。

# 使用enrichGO函数进行基因本体（GO）富集分析
# gene = entrez_ids$ENTREZID：指定输入的基因列表，这里使用之前转换得到的Entrez ID
# OrgDb = "org.Hs.eg.db"：指定使用人类基因注释数据库
# keyType = "ENTREZID"：指定输入基因标识符的类型为Entrez ID
# ont = "ALL"：指定分析所有三种GO本体（生物过程BP、细胞组分CC、分子功能MF）
# pAdjustMethod = "BH"：指定使用Benjamini-Hochberg方法进行多重比较校正
# qvalueCutoff = 0.05：指定校正后的p值（q值）的阈值为0.05，只有q值小于该阈值的GO项才会被保留
# readable = TRUE：将输出结果中的ENTREZID转换为基因符号（SYMBOL）
go_enrichment <- enrichGO(gene = entrez_ids$ENTREZID, 
OrgDb = "org.Hs.eg.db",
                          keyType = "ENTREZID", 
ont = "ALL",
                          pAdjustMethod = "BH", 
qvalueCutoff = 0.05,
                          readable = TRUE)

# 查看富集分析结果
# 使用print函数和summary方法打印GO富集分析的摘要结果
print(summary(go_enrichment))

# 将富集分析结果保存为CSV文件
# 使用write.csv函数将富集分析结果保存到指定路径的CSV文件中
write.csv(go_enrichment, file = "go_enrichment_results.csv", row.names = FALSE)

# 可视化 GO 富集分析结果
# 使用 dotplot 函数生成 GO 富集分析的点图
p <- dotplot(go_enrichment)  # 生成点图对象

# 生成按本体（ONTOLOGY）分类的点图，并使用 facet_grid 分面显示
dotplot(go_enrichment, split = "ONTOLOGY") + facet_grid(ONTOLOGY ~ ., scale = "free")  

# 使用 barplot 函数生成 GO 富集分析的柱状图
barplot(go_enrichment)

KEGG 富集分析

# 使用 enrichKEGG 函数进行 KEGG 通路富集分析
# gene = entrez_ids$ENTREZID：指定输入的基因列表（Entrez ID）
# organism = "hsa"：指定分析的生物物种为人类（hsa）
# keyType = "kegg"：指定输入基因标识符的类型为 KEGG ID
# pAdjustMethod = "BH"：指定使用 Benjamini-Hochberg 方法进行多重比较校正
# qvalueCutoff = 0.05：指定校正后的 p 值（q 值）的阈值为 0.05
kegg_enrichment <- enrichKEGG(gene = entrez_ids$ENTREZID, 
organism = "hsa",
                              keyType = "kegg", 
pAdjustMethod = "BH", 
qvalueCutoff = 0.05)
# 将输出结果中的ENTREZID转换为基因符号（SYMBOL）
kegg_enrichment=DOSE::setReadable(kegg_enrichment, OrgDb='org.Hs.eg.db',keyType='ENTREZID')
# 查看 KEGG 富集分析结果
print(summary(kegg_enrichment))  

# 将 KEGG 富集分析结果保存为 CSV 文件
write.csv(kegg_enrichment, file = "D:\\Users\\Desktop\\call-task_KEGG_enrichment\\kegg_enrichment_results.csv", row.names = FALSE)

# 可视化 KEGG 富集分析结果
p1 <- dotplot(kegg_enrichment)  
# 使用 barplot 函数生成 KEGG 富集分析的柱状图
barplot(kegg_enrichment)

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