发布时间：2015-01-19 来源：人大经济论坛

从噬菌体表面展示环状7肽肽库中筛选葡萄球菌B型肠毒素抑制剂_药学专业毕业论文 作者：李韩平，周宏，郑玉玲，邓小红，马茹，姜永强 【关键词】 葡萄球菌B型肠毒素 Screening inhibitor of Staphylococcal enterotoxin B from random circular 7mer peptide library displayed on phage 【Abstract】 AIM: To obtain the specific peptide which can bind with SEB and inhibit SEBs enterotoxin activity by panning from the random circular 7mer polypeptide libraries. METHODS: The affinity of peptide and the competitive activity of the synthetic peptide with that of antiSEB monoclonal antibody (McAb) were detected respectively by PhageELISA and competition ELISA. Animal experiment was performed to assess the suppressive effect of the screened peptide on the toxicity of SEB and its enterotoxin. RESULTS: The circular 7mer peptide obtained by panning suppressed the multiplication of spleen lymphocytes in mice. At the ratio of 160:1 (SEB: synthetic 7mers peptide), the peptide protected the little cats from attack of enterotoxin and the survival rate of mice treated with the screened peptide was significantly higher compared with that of the control group. CONCLUSION: The obtained peptide specifically combines with SEB and suppresses its enterotoxin activity, which paves the way for the development of SEB inhibitors. 【Keywords】 staphylococcal enterotoxin B; peptide library; screening; inhibitor 【摘要】 目的： 拟通过生物淘选从噬菌体表面展示环状7肽肽库中筛选出与葡萄球菌B型肠毒素(Staphylococcal enterotoxin B, SEB)结合并能抑制该毒素毒性效应的特异性短肽. 方法： 采用PhageELISA来鉴定所得目的肽的亲和性；利用竞争ELISA研究合成肽与SEB mAb竞争结合SEB的情况；通过动物实验考察其抑制SEB的超抗原特性和肠毒活性情况. 结果： 筛选所得短肽在一定浓度范围内可以抑制SEB对鼠脾淋巴细胞的激活；合成肽与SEB质量比160∶1下，合成肽可较好地抑制SEB对乳猫的肠毒活性，并对SEB引起的小鼠致死具有明显保护作用. 结论： 得到了能与SEB特异结合并能抑制SEB超抗原特性和肠毒活性的短肽. 【关键词】 葡萄球菌B型肠毒素；肽库;筛选;抑制剂 0引言 葡萄球菌B型肠毒素(Staphylococcal enterotoxin B, SEB)［1］是超抗原(SAg)家族的主要成员之一，该毒素可以造成食物中毒，严重时甚至导致致死性休克. SEB中毒后缺乏特异的治疗手段，因此研究SEB的特异高效抑制剂具有重大的意义. 我们利用固相筛选方法，即以SEB作为亲和靶标蛋白，从环状7mer肽噬菌体文库中筛选到与SEB结合，并能抑制该毒素毒性效应的噬菌体克隆. 结果表明，所筛选环状7mer肽在细胞水平上可抑制SEB对小鼠脾细胞的激活，在整体动物水平上对SEB导致的毒性具有一定保护作用. 1材料和方法 1.1材料 环状7mer肽噬菌体文库( Random circular 7mers peptide library displayed on phage)为New England BioLabsInc产品; M13噬菌体单链DNA提取试剂盒为Qiagen公司产品； SEB单克隆抗体由本室保存; DGal(D半乳糖)为Sigma产品；抗M13噬菌体mAb、CM Sepharose FF为Amesham产品; BCA蛋白定量试剂为Pierce产品.乳猫BALB/C实验动物由军事医学科学院丰台实验中心提供并饲养. 1.2方法 随机肽库的扩增、定量按照所附试剂盒说明书进行；纯化按QIAprepM13 Handbook进行. 亲和靶标蛋白SEB的分离纯化与定量按文献［2］方法进行. 依据优势噬菌体阳性克隆序列合成相应的多肽,由军事医学科学院六所合成, 并进行了多肽纯化和脱盐处理,合成多肽的纯度达95%以上. 将纯化的SEB与0.1 mol/L NaHCO3(pH 8.6)相混合, 制成质量浓度为1 g/ L的溶液,取100 μL混合液加于酶联条微孔进行包板固定，于4℃过夜；次日弃包被液后，加200 μL浓度为 50 g/L BSA于酶联孔中进行封闭，37℃结合2 h,间隙振荡；弃封闭液，取100 mL/L TBST液200 μL洗涤6次,间隔为5 min/次,然后将10 μL肽库原液加于含有100 μL TBST的酶联孔中,室温轻摇过夜;次日弃未结合的噬菌体,取100 ml/L TBST 200μL洗涤10次,间隔为3 min/次,最后加80 μL洗脱缓冲液,室温轻柔吹打10 min后,将洗脱得到的噬菌体转入微量离心管中,立即加入15 μL 1 mol/L TrisHCL(pH 9.1)进行中和. 将所得噬菌体进行感染、扩增、纯化后进行下一轮筛选. 在后续的筛选中TBST的浓度增为500 mL/L. 随机挑取第3轮噬菌体单克隆进行培养后进行PhageELISA分析及DNA序列测定. 将SEB包被酶联板，经30 g/L BSA封闭后加入培养好的单克隆上清，采用PhageELISA法检测SEB与噬菌体的结合情况. ssDNA的提取