浅谈高效液相色谱法测定白花蛇舌草中槲皮素的含量_药学论文
发布时间：2014-11-07
来源：人大经济论坛
【摘要】 目的 建立高效液相色谱法测定白花蛇舌草中槲皮素含量的方法。方法 采用Hypersil BDS C18色谱柱(4.6 mm×200 mm，5 μm)，流动相为甲醇水磷酸(体积比50∶50∶0.2) ，检测波长为370 nm。结果 槲皮素在0.08～ 0.32 μg 的范围内与峰面积呈良好线性关系(r=0.999 6)，平均加样回收率为101.5%，RSD为0.8%(n=6)。结论 本法快速、简便、准确，可用于测定白花蛇舌草中槲皮素的含量，为评价白花蛇舌草的内在质量提供科学依据。
【关键词】 白花蛇舌草 槲皮素 含量测定 高效液相色谱法
Abstract:Objective To determine the content of quercetin in Hedyotis diffusa Willd. Methods The analysis was performed on an HPLC C18 column (4.6 mm×200 mm，5 μm) at the detection wavelength of 370 nm. The mobile phase consisted of 0.2% phosphoric acidmethanol (50∶50) with a flow rate of 1 mL/min. Results The calibration curve was linear in the range of 0.08-0.32 μg of quercetin (r=0.999 6).The average recovery was 101.5% with RSD 0.8% (n=6).Conclusion The method is simple，rapid and accurate for the determination of quercetin in Hedyotis diffusa Willd, which could be used for the quality control of Hedyotis diffusa Willd.
Key words:Hedyotis diffusa Willd.; quercetin; HPLC
白花蛇舌草为茜草科植物白花蛇舌草(Hedyotis diffusa Willd.)的干燥全草，研究表明该植物主要含有黄酮类、三萜类、蒽醌类、环烯醚苷萜类、甾醇类、烷烃类等化学成分，具有抗肝炎、抗肿瘤、抗病毒、抗炎抑菌、降血脂及降血糖等多种药理活性[1]。白花蛇舌草中黄酮类化合物的含量测定未见文献报导，本文采用HPLC法测定了白花蛇舌草中槲皮素的含量，为评价白花蛇舌草的内在质量提供科学依据。
1 仪器与药品
高效液相色谱仪：P230高压恒流泵/DAD230二极管阵列检测器(大连依利特分析仪器有限公司)，Hypersil BDS C18色谱柱(4.6 mm×200 mm，5μm，大连依利特分析仪器有限公司);电子精密天平(Ohaus);KS1500超声清洗器(宁波科胜仪器厂);高速万能粉碎机(天津市泰斯特仪器有限公司)。
白花蛇舌草(市售，批号2006001，2006002，2006003)，经本校药植教研室陈再兴老师鉴定均为白花蛇舌草(Hedyotis diffusa Willd.);槲皮素对照品(中国药品生物制品检定所，批号100081-200406，供含量测定用);甲醇为色谱纯;水为重蒸水。
2 结果与分析
2.1 色谱条件
色谱柱：Hypersil BDS C18色谱柱(4.6 mm×200 mm，5 μm)，流动相：甲醇水磷酸(体积比50∶50∶0.2);检测波长：370 nm，流速：1 mL/min，柱温：25 ℃ ，进样量：20 μL。色谱图见图1、2。
2.2 对照品溶液的制备
精密称取经五氧化二磷干燥过夜的槲皮素对照品适量，加甲醇制成每1 mL含槲皮素10 μg的溶液，即得。
3 样品溶液的制备
取白花蛇舌草药材粗粉1.0 g，精密称定，置烧瓶中，精密加入50%(体积分数)甲醇20 mL和盐酸1 mL，密塞，称定重量，加热回流2 h，放冷，用50%(体积分数)甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液5 mL，置10 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，用微孔滤膜 (0.45 μm) 滤过，取续滤液，即得。
2.4 系统适用性试验
分别取对照品溶液、供试品溶液各20 μL进样测定，理论塔板数为15 000，供试品溶液色谱图中槲皮素峰与相邻杂质峰的分离度大于1.5。
2.5 线性关系的考察
精密称取经五氧化二磷干燥过夜的槲皮素对照品10.0 mg，加甲醇定容至100 mL，分别精密量取上述对照品溶液0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6 mL 置10 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，制成系列浓度的溶液。分别精密吸取各溶液20 μL，注入液相色谱仪，记录色谱图。以槲皮素峰面积(A)为纵坐标，槲皮素进样量(m)为横坐标，绘制准曲线，得回归方程为 A=274.79m+54.43，r=0.999 6，结果表明槲皮素在0.08～0.32 μg范围内与峰面积成良好线性关系。
2.6 精密度试验
取槲皮素对照品溶液20 μL ，重复进样6次分别测定峰面积为2 949，2 911，2 891，2 946，2 950，2 957， RSD为0.9%(n=6)，结果表明精密度良好。
2.7 稳定性试验
取供试品溶液(批号2006001)，分别在2、4、6、8、10、12 h进样，测得槲皮素峰面积为1 437，1 422，1 451，1 430，1 421，1 425，RSD为0.8%，结果表明供试样品溶液在12 h内稳定。
2.8 重现性试验
取同一批号的白花蛇舌草5份，按2.3制备样品溶液，进行测定，测得槲皮素的峰面积为1 447，1 452，1 425，1 419，1 423，RSD为1.1%(n=5)，结果表明该方法重现性良好。
2.9 回收率试验
精密称取已知含量的白花蛇舌草(批号2006001)5份，分别加入槲皮素对照品适量，按2.3制备供试品溶液，测定含量，结果测得回收率101.8%，102.4%，101.9%，101.1%，100.4%，平均值为101.5%;RSD为0.8%。
2.10 样品测定
分别取白花蛇舌草药材3批(批号2006001，2006002，2006003)，按2.3制备供试品溶液，进样测定，结果测得槲皮素质量分数分别为：0.091 3，0.085 7和0.088 0 mg/g。
3 讨 论
3.1 文献报道槲皮素的检测波长为360nm[2,3]、254 nm[4] 、368 nm[5]，本文利用DAD二极管阵列检测器对槲皮素对照品进行全波长扫描，结果最大吸收峰为370.2 nm，故选择370 nm为检测波长，见图3。
3.2 实验考察了不同比例的甲醇水为流动相，最后确定流动相为甲醇水磷酸(体积比50∶50∶0.2)，柱温25 ℃，流速1 mL/min，样品中槲皮素达到良好的分离。
3.3 白花蛇舌草中黄酮类化合物的含量测定未见文献报导，本文采用高效液相色谱法测定了白花蛇舌草药材中槲皮素的含量，操作简便、快速，可作为白花蛇舌草质量控制的有效手段。
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