发布时间：2014-12-23 来源：人大经济论坛

基质细胞衍生因子在哮喘小鼠气道中的表达_药学专业毕业论文 【摘要】  目的观察基质细胞衍生因子-1(stromal-derived factor-1, SDF-1)在鸡卵清蛋白(OVA)诱导小鼠哮喘模型中的表达，探索哮喘气道重塑的发生机制。方法40只雌性SPF级C57BL/6小鼠，体重18～22g，随机分为哮喘组和对照组。按照文献方法建立OVA小鼠哮喘模型。两组动物于末次雾化结束后24h处死，取肺组织行病理切片，苏木精-伊红染色(HE)观察肺脏的组织病理学变化;逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)、免疫印迹法(Western blot)、免疫组织化学(immunohistochemistry, IH)技术检测肺组织SDF-1的表达。结果①哮喘组支气管上皮细胞脱落、气道壁增厚，细支气管和血管周围有大量炎细胞浸润;②哮喘组肺组织SDF-1在RT-PCR、Western blot及IH中均为阳性表达，而对照组则否。结论小鼠哮喘时肺组织分泌大量细胞趋化因子SDF-1，可能是哮喘气道重塑的重要因素之一。 【关键词】  基质细胞衍生因子;哮喘;气道重塑 ABSTRACT: ObjectiveTo study the expression of stromal-derived factor-1 (SDF-1) in the airway of mice with allergic asthma induced by ovalbumin (OVA) so as to explore the mechanism of asthmatic airway remodeling.MethodsForty female C57BL/6 mice of SPF grade were randomly divided into asthma group and control group with 20 in each. Mice were sensitized and challenged with ovalbumin to establish the asthmatic model. All the mice were killed 24 hours after the last aerosolisation. The paraffin embedded sections of lung tissues were stained with hematoxylin and eosin (HE) for analyzing pathological changes. SDF-1 mRNA extracted from lung tissues was assessed by RT-PCR while SDF-1 protein extracted from lung tissues was assessed by Western blot and immunohistochemistry (IH).Results① After repeated allergen challenge, obvious infiltration of inflammatory cells and proliferation of goblet cells and smooth muscles appeared in mouse bronchi. ② According to RT-PCR and Western blot and IH results, the expression of SDF-1 was positive in asthma group but negative in control group.ConclusionA large amount of SDF-1 is secreted in the lung tissues in asthmatic mice, which may be one of the critical factors in asthmatic airway remodeling. KEY WORDS: stromal-derived factor-1; asthma; airway remodeling 支气管哮喘是一种慢性气道炎症，伴有气道高反应性和气道重塑，而气道重塑则是一个在慢性炎症基础上的异常损伤修复过程。基质细胞衍生因子-1(stromal-derived factor-1, SDF-1)是由基质细胞产生的一种CXC型趋化因子。近年来研究表明，基质细胞衍生因子对组织或器官的创伤、炎症损伤修复起到了重要的作用。但是，SDF-1与哮喘相关性的研究目前还未见报道，我们就此进行了探讨。 1材料与方法 1.1药品与试剂鸡卵清蛋白(OVA)Ⅴ级(美国GBICO公司);氢氧化铝干粉(郑州派尼化学试剂公司);PBS(美国GBICO公司);SDF-1兔抗小鼠一抗(武汉博士德生物有限公司);过氧化物酶标记羊抗兔二抗(美国DAKO公司);ECL发光液(北京碧云天公司);兔抗小鼠内参β-actin(北京博奥森公司);免疫组织化学试剂盒(美国DAKO公司)。 1.2方法 1.2.1哮喘模型的制备小鼠哮喘模型实验参考文献[1]，略有变动。实验动物为40只雌性SPF级C57BL/6小鼠(第四军医大学动物中心提供)，体重18～22g，随机分为哮喘组和对照组。按照文献方法[1]构建哮喘模型：0、7、14d于小鼠腹腔内注射致敏液0.2mL/只(致敏液为每0.2mL PBS溶液内含10μg OVA、20μg氢氧化铝)。于第21天开始0.5g/L浓度的OVA生理盐水溶液雾化，每次30min，隔日1次，共计18次。对照组用空白PBS及生理盐水，余同模型组。两组动物于雾化结束后24h处死，取右肺于40g/L甲醛溶液中固定，石蜡包埋，用于病理观察及免疫组织化学(IH)检测;取左肺于液氮中保存，用于RT-PCR及Western-blot测定SDF-1。 1.2.2RT-PCR法检测SDF-1的表达提取肺组织总RNA，分光光度仪上定量及检测RNA纯度，用两步法RT-PCR。SDF-1上游引物：5′-CACTTTC-ACTCTCGGTCCAC-3′，下游引物为：5′-CTGAAG-GGCACAGTTTGGAG-3′，序列长度约500bp。PCR反应条件：94℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸1min，30个循环。RT-PCR产物以10g/L琼脂糖凝胶电泳，电泳结果在GDS-8000数码成像及分析系统上观察、拍照。 1.2.3Western blot法检测SDF-1的表达左上肺组织用液氮粉碎及超声提取总蛋白后，每组取400μL总蛋白，加入等体积的2×SDS凝胶加样缓冲液，100℃ 5min使蛋白变性;经120g/L SDS变性聚丙烯酰胺凝胶电泳后，电转印至PVDF膜;50g/L脱脂奶粉封闭后，SDF-1兔抗小鼠一抗(1∶200)及兔抗小鼠内参β-actin(1∶200)孵育4℃过夜，辣根过氧化物酶标记羊抗兔二抗(1∶500)37℃孵育2h后，ECL试剂进行检测，在Flourchem FC2成像及分析系统中观察、拍照。 1.2.4免疫组织化学法检测SDF-1的表达哮喘组及对照组肺组织蜡块连续石蜡切片，经脱蜡至水后以0.3mL/L过氧化氢溶液浸泡10min，灭活内源性过氧化物酶;抗原热修复后以正常山羊血清封闭，分别加一抗即兔抗小鼠SDF-1抗体1∶200，4℃过夜;加生物素标记的二抗(羊抗兔IgG 1∶200)，37℃，40min;加新鲜配制的二氨基联苯胺(DAB)显色，苏木精复染细胞核，显微镜下观察5～10min，棕黄色染色为阳性信号。 1.3统计学分析应用SPSS16.0软件包行统计学分析。实验数据以均数±标准差表示，采用两样本t检验处理统计学数据，P0.05为差异具有统计学意义。 2结果 2.1小鼠的一般情况及肺组织病理学改变哮喘组小鼠经激发后，出现烦躁不安，呼吸急促，腹部翕动，易激惹;对照组小鼠行动敏捷，一般情况未见异常。哮喘组小鼠肺组织切片HE染色可见，小鼠细支气管周围和血管周围有大量的淋巴细胞、单核细胞和多形核细胞浸润，并伴有上皮脱落，气道壁增厚。对照组病理切片无上述表现(图1)。图1小鼠肺组织的病理学改变Fig.1 HE staining of lung histological sections (HE, ×100)A：对照组;B：哮喘组。 2.2RT-PCR琼脂糖凝胶电泳结果哮喘组于500bp处出现特异性扩增条带，与预期趋化因子SDF-1扩增片段一致;对照组无特异性扩增条带。正常肺组织几乎无SDF-1 mRNA，哮喘时肺组织有SDF-1 mRNA(图2、表1)。图2RT-PCR法检测两组小鼠肺组织SDF-1mRNA的表达