发布时间：2015-01-27 来源：人大经济论坛

MAPK信号途径介导的17β-雌二醇快速激活人精子的研究_临床医学专业毕业论文范文 【摘要】 目的　观察17β-雌二醇(E2) 对人精子快速的非基因组激活效应，并探讨其相关的作用机制。方法雌激素受体拮抗剂Tamoxifen (0.05μmol/L)预处理20min后，分别用E2 (1μmol/L)、雌二醇-牛血清白蛋白结合物（E2-BSA，5μmol/L）作用获能人精子15min，以三色法染色检测获能人精子顶体反应率，Western blotting检测丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)蛋白的表达变化。结果E2、E2-BSA均能提高人精子的顶体反应率和促进p42/p44磷酸化MAPK蛋白的表达，且两者的作用均可被Tamoxifen所阻断。结论人精子膜上可能存在膜雌激素受体(mER)，雌激素与mER结合后可通过MAPK信号途径快速激活人精子。 【关键词】 17β-雌二醇； 人精子；顶体反应；膜雌激素受体；丝裂原活化蛋白激酶 AbstractObjective　To study the rapid non-genic effect and mechanism of 17β-estradiol on human spermatozoon activation.Methods　Human spermatozoa were cultivated with E2(1μmol/L) or E2-BSA(5μmol/L) for 15 minutes after treated with tamoxifen(0.05μmol/L)for 20 minutes.Acrosome reaction rates were scored by trichrome staining and MAPK activity was determined by Western blotting.ResultsE2 or E2-BSA significantly increased the acrosome reaction rates and MAPK activity (p42/p44).The effects of E2 or E2-BSA were able to be inhibited by tamoxifen.ConclusionsThere may be some membrane estrogen receptors on the human spermatozoa,which mediate the rapid activational effects of estrogen on human spermatozoa through MAPK pathways. KEYWORDShuman spermatozoonacrosome reactionmembrane estrogen receptormitogen-activated protein kinase 越来越多的研究资料证明，雌激素在精子的成熟及精子功能的获得中都起着非常重要的调节作用，体外环境下，雌激素对精子有一定的激活效应，在精子运动力的获得、精子蛋白的酪氨酸磷酸化、获能、顶体反应和受精等过程中有重要的促进作用［1］ 。但迄今为止，雌激素人精子激活作用的机制尚未完全阐明。为此，本实验用17β-雌二醇（E2）作用正常人获能精子，观察雌激素对人精子激活的指标之一顶体反应的影响，并探讨参与该过程的MAPK信号通路。 1　材料与方法 1.1材料 1.1.1主要试剂 17β-雌二醇（E2）、雌二醇-牛血清白蛋白复合物（E2-BSA）、牛血清白蛋白（BSA）、雌激素受体(ER)拮抗剂Tamoxifen均购自Sigma公司；兔抗p-44/42单克隆抗体购自Cell Signaling公司；化学发光增强剂购自New England Biolabs公司；台盼蓝购自Chroma公司；俾士麦棕Y购自美国Schmid GMBH公司；玫瑰红购自Fluka公司。 1.1.2精液标本采集实验所用33例精液标本来自年龄25~45岁﹑有正常生育史﹑身体健康的成年男性志愿者，其精液常规各项指标符合WHO制定的正常精液常规标准［2］。 1.1.3精子悬液制备供精者禁欲3~7d后手淫获取精液，将精液标本置于37℃孵箱（5％CO2）中40min，使其完全液化。用上游技术获取活动良好的精子，经BWW低蛋白液（含0.3%BSA）洗涤3次后，用BWW获能液（含3.5%BSA）调整精子密度至20×109/L，在孵箱中孵育4h使精子获能。 1.2方法 1.2.1三色法检测精子顶体反应（AR）率经各实验因素处理后，获能精子悬液与1%的台盼蓝以体积比3：1混合，37℃孵育20min，离心、无蛋白BWW液洗涤2次，涂片、室温干燥，75%乙醇固定30min，双蒸水冲洗、俾士麦棕Y染色、玫瑰红复染，最后用85%，95% 和100%的乙醇逐级脱水、二甲苯透明，树脂封片后观察。每张涂片在油镜下计数200个精子，计算AR率。 1.2.2Western blotting检测精子磷酸化MAPK蛋白（p42/p44）表达精子经实验因素处理后进行离心、裂解，用BCA法测定精子蛋白浓度［3］。所得蛋白提取液进行SDS-PAGE电泳，以湿转法将蛋白转移至PVDF膜上，封闭1h后，加入一抗体（抗p42/p44磷酸化单克隆抗体，1:3000）室温孵育1h，PBST洗膜3次，之后加入二抗（HRP标记羊抗鼠IgG，1:5000）室温孵育1h，PBST洗膜3次，与ECL发光底物反应2min，X光片曝光、显影定影。用抗人肌动蛋白抗体β-action作为内参照，进行二次免疫印迹。用图像处理系统对X光片进行扫描测定感光区带的灰度值，以p42/p44蛋白条带与β-action条带的比值表示磷酸化p42/p44 MAPK蛋白的表达量。 1.2.3统计学处理实验数据均以±s表示，利用SPSS11.5统计学软件进行方差分析，P＜0.05被认为有统计学意义。