发布时间：2015-02-01 来源：人大经济论坛

和营安心方对慢性心衰大鼠心肌细胞凋亡的影响_临床医学专业毕业论文 慢性心衰属于虚劳心损的范畴，《难经》认为损其心者，调其营卫，我们宗《难经》之旨，确立了调和营卫、化淤利水的慢性心衰治则，组成和营安心方。本实验观察了和营安心方对慢性心衰大鼠心肌细胞凋亡的影响。 1 材料与方法 1.1 材料雄性Wistar大鼠70只，体重200～240 g，购自河北省实验动物中心；和营安心方由西洋参6 g，玉竹15 g，云茯苓15 g，桂枝15 g，丹参20 g等组成，中剂量组水煎浓缩为1∶1煎液（每毫升含生药1 g）、大剂量组为1∶2煎液（每毫升含生药2 g）、小剂量组为2∶1煎液（每毫升含生药0.5 g），药物购自北京同仁堂药店；盐酸异丙肾上腺素注射液，2 ml∶1 mg/支，上海禾丰制药有限公司；卡托普利，25 mg/片，常州制药厂有限公司；参麦注射液，10 ml/支，河北神威药业有限公司；MK1020原位细胞凋亡检测试剂盒，武汉博士德生物工程公司；Bax，Bcl-2一抗，二步法TV6001免疫组化检测试剂盒，北京中杉金桥生物技术公司。 1.2 方法 在参考文献的基础上［1，2］，略加改进并经预实验证实，采取皮下多点注射异丙肾上腺素（ISO）的方法，第1天按20 mg/kg，第2天按10 mg/kg，第3～12天按5 mg/kg的剂量连续皮下给药，另取11只大鼠为正常对照组，皮下注射等量蒸馏水。造模结束后随机取2只正常大鼠、5只造模大鼠测定血流动力学指标，两组指标差异明显，确认模型制备成功。造模大鼠随机分为模型对照组，参麦注射液组，卡托普利组，和营安心大、中、小剂量组，每组9只。以人与大鼠体表面积等效剂量比折算量为和营安心中剂量组，扩大两倍为大剂量组，缩小两倍为小剂量组，每次灌胃0.8 ml/100 g，1 次/d；卡托普利组配成0.45%蒸馏水溶液，每次灌服1 ml/100 g；正常对照组及模型对照组灌服蒸馏水1 ml/100g；参麦注射液组每天按5 ml/kg腹腔注射参麦注射液；连续给药4周。 1.3 观测指标 1.3.1 血流动力学指标测定实验结束，大鼠腹腔注射20%乌拉坦麻醉（1 ml/100 g），游离右侧颈总动脉并插入自制的心室插管（充满1%肝素），通过左侧动脉瓣和房室瓣进入左心室，用多导生理记录及分析系统描记记录左室内压峰值（LVSP）、左室舒张末压（LVEDP）、左室内压上升、下降最大速率（±dp/dtmax）。 1.3.2 心重指数开胸提起心脏，按相同位置剪断肺静脉、肺动脉、主动脉和上下腔静脉，取出心脏，分析天平称取心脏重量，计算心重指数（心重mg/体重g）。 1.3.3 TUNEL法检测心肌细胞凋亡［3］纵向剪开左心室，从乳头肌处横切0.3 cm×0.5 cm的心肌标本，置于10%中性甲醛固定，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，石蜡包埋切片，按照试剂盒说明严格进行操作，用TUNEL法检测心肌细胞凋亡，以细胞核染成棕褐色为阳性结果，每组每个心肌标本各取1张切片，每张切片计数5个高倍视野（400×），计算各组每高倍视野阳性细胞数。 1.3.4 心肌Bax，Bcl-2蛋白表达及Bcl-2/Bax比值按照二步法TV6001免疫组化试剂盒的说明进行操作，每组每个心肌标本连续切片，Bax，Bcl-2染色各取1张切片，棕褐色阳性颗粒主要表达于细胞浆，采用计算机图像分析系统进行半定量分析，摄取400×图像输入分析系统内，测定各组图像的平均灰度值，每张切片于阳性区选择5个无重叠视野，以灰度值大小作为待测蛋白的阳性表达指数，并计算Bcl-2/Bax比值。 1.4 统计分析实验数据用±s表示，应用SPSS12.0进行统计学处理，用单因素方差分析进行组间比较。 2 结果 2.1 和营安心方对血流动力学、心重指数的影响结果见表1。与正常对照组比较，模型对照组LVEDP明显升高，LVSP，±dp/dtmax明显降低，心重指数明显增加，差异有统计学意义（P0.01）；与模型对照组比较，和营安心方大、中剂量组LVEDP明显降低，LVSP，±dp/dtmax明显升高，心重指数降低，治疗效果接近卡托普利组，差异有统计学意义（P0.01或P0.05），说明和营安心方对慢性心衰血流动力学、心重指数有良好改善作用。 表1 和营安心方对血流动力学、心重指数的影响（略） 与正常对照组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01；与模型对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01 2.2 TUNEL法检测心肌细胞凋亡结果正常对照组大鼠心肌未发现细胞凋亡，模型对照组大鼠心肌细胞凋亡严重，凋亡细胞呈孤立、散在分布，数明显增多，核内有分布均匀的棕褐色颗粒，体积等于或小于正常胞核，每20×20视野平均3.9个；和营安心大剂量组、卡托普利组每高倍视野平均1.5个、1.8个，棕褐色细胞核数量较少；和营安心中剂量组、小剂量组、参麦注射液组每高倍视野平均2.3，2.9，2.7个，棕褐色细胞核仍较多见。可见，各治疗组心肌细胞凋亡数明显低于模型对照组，和营安心大剂量组、卡托普利组改善慢性心衰大鼠心肌细胞凋亡的效果最好。