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补肾健脾法对卵巢早衰小鼠抑制素B含量及基因表达的影响_药学专业毕业论文

发布时间:2014-12-16 来源:人大经济论坛
补肾健脾法对卵巢早衰小鼠抑制素B含量及基因表达的影响_药学专业毕业论文 【摘要】 【目的】观察补肾健脾法中药复方对卵巢早衰(POF)小鼠抑制素B(INHB)含量及基因表达的影响。 【方法】选用雌性BALB/c小鼠随机分为正常对照组、模型组、中药预防组和中药治疗组。除正常对照组外,其他3组采用SD大鼠卵巢抗原与弗氏佐剂注射免疫法复制自身免疫性卵巢功能衰退小鼠模型。中药预防组于第1次免疫后开始灌服中药复方汤剂,连续17 d,中药治疗组于第3次免疫后开始灌服中药复方汤剂,连续5 d,剂量均为20 g·kg-1·d-1。采用酶联免疫吸附法检测各组血清INHB含量,逆转录聚合酶链反应(RTPCR)法检测各组卵巢组织INHB mRNA表达水平,并观察各组小鼠卵巢病理改变。 【结果】模型组小鼠血清INHB含量、卵巢组织INHB mRNA相对表达量均显著降低(P0.05或P0.01),光镜下未见明显生长或成熟卵泡;中药预防组血清INHB含量、卵巢组织INHB mRNA相对表达量均显著升高(P0.05或P0.01),卵泡数目略减少,无明显病理改变;中药治疗组卵巢组织INHB mRNA相对表达量显著升高(P0.05),而对血清INHB含量无影响(P0.05),生长成熟卵泡减少,且卵巢组织出现病理改变。各组小鼠血清INHB含量与卵巢组织INHB mRNA表达变化呈相似趋势,且中药预防组作用优于中药治疗组。 【结论】补肾健脾法中药复方治疗卵巢早衰的作用与其能增强卵巢组织INHB mRNA表达,升高INHB含量,改善卵巢的储备功能有关。 【关键词】  卵巢早衰/中药疗法;补肾健脾法;基因表达调控;卵巢/病理学;疾病模型,动物;大鼠;小鼠 Abstract:ObjectiveTo probe the mechanism of the Chinese compound recipe, which has the actions of tonifying the kidney and strengthening the spleen, on inhibin B (INHB) content and its gene expression level in mice with immune premature ovarian failure (POF). MethodsFemale BALB/c mice were divided into 4 groups randomly: normal control group, model group, treatment group and prevention group. The autoimmune POF were induced in BALB/c mice except for the normal control group. Treatment group were treated with Chinese compound recipe (20 g·kg-1·d-1) for 5 continuous days after the third immunization, and prevention group were given Chinese compound recipe for 17 continuous days after the first immunization. The mice serum INHB content was (Continued on page 591) 卵巢早衰(premature ovarian failure,POF)是引起卵巢功能衰退常见的疾病,其发病率在妇女中占1%~3%,占继发性闭经的2%~10%[1],是当今生殖医学和生殖健康研究的热点和难点。研究认为卵巢储备功能低下的妇女,卵泡颗粒细胞抑制素的产生减少,不能将卵泡刺激素(FSH)抑制在正常范围内,提示卵泡衰老[2]。维持卵泡完整性所需蛋白质mRNAs的变化,预示凋亡过程的开始[3],而闭锁过程是促进或抑制凋亡的关键基因产物有序表达的结果[4]。临床研究表明[5]补肾健脾中药对卵巢功能早衰患者具有较好疗效。本研究观察了补肾健脾中药对POF小鼠抑制素B(INHB)及其基因表达的影响,现报道如下。 1材料与方法 1.1动物健康BALB/c小鼠,雌性,SPF级,8~10周龄,体质量18~22 g;SD大鼠,雌性,SPF级,体质量约250 g,均由广州中医药大学实验动物中心提供,大小鼠合格证号:0016889和0016888。 1.2主要试剂及仪器弗氏完全佐剂(CFA)和弗氏不完全佐剂(IFA)均为美国Sigma公司产品,小鼠INHB试剂盒为美国Rapid Bio Lab公司产品, Model 550 microplate reader为美国BioRad公司产品,逆转录聚合酶链式反应(RTPCR)试剂、逆转录酶均为北京索奥公司产品,GDS7600凝胶扫描系统(DF23B)为英国UVP公司产品,PE9700PCR扩增仪为美国PE公司产品。 1.3药物补肾健脾法中药复方由菟丝子、党参、枸杞子、淮山、仙灵脾、女贞子、杜仲等组成,并制成浓缩液,含生药1 g/L。 1.4卵巢抗原的制备收集SD雌性大鼠的卵巢组织,称质量,洗净,于TrisHCl缓冲液(pH 7.6、0.05 mmol/L,150 mmol/L NaCl,4 mmol/L乙二胺四乙酸,2 mmol/L柠檬酸,0.1 mmol/L苯甲基磺酰氟)中剪碎并研磨成匀浆,低温下超声粉碎5 min,低温离心(4 000 r/min×15 min,10 000 r/min×5 min)取上清,调整浓度为200 mg/mL,置于-20℃保存。 1.5自身免疫性卵巢功能衰退小鼠动物模型复制 [6]免疫前通过阴道脱落细胞涂片筛选正常性周期小鼠,每只小鼠两后脚掌和腹部多点皮下注射:10 mg(0.05 mL)卵巢抗原加CFA混合乳化液0.1 mL。首次免疫间隔1周,以卵巢抗原与IFA等量乳化加强免疫1次,5 d后再加强免疫1次。第3次免疫后5 d处死小鼠,摘眼球留取血清,收集卵巢组织,待检测。 1.6分组及给药将雌性BALB/c小鼠随机分为4组,每组5只。正常对照组以磷酸盐缓冲液(PBS)代替卵巢抗原免疫,不灌服药物;模型组不灌服药物;中药预防组于第1次免疫后即开始灌服中药复方汤剂以预防POF的发生,剂量为20 g·kg-1·d-1,连续17 d;中药治疗组于第3次免疫后开始灌服中药复方汤剂,剂量为20 g·kg-1·d-1,连续5 d。 1.7取材及指标检测取血清采用双抗体夹心酶联免疫吸附(SandwichELISA)法检测INHB水平;取卵巢组织采用RTPCR法检测INHB mRNA的表达,GAPDH为内参照进行RTPCR扩增。指标检测均参考说明书进行。另取卵巢组织固定包埋切片染色后在光镜下行组织病理学检查。 1.8统计学方法采用SPSS 11.5统计学软件进行数据分析。 2结果 
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