发布时间：2014-12-23 来源：人大经济论坛

耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的基因多态性分型研究_药学专业毕业论文范文 【摘要】  目的探索一种准确、快速、可靠的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)的分子生物学分型方法，了解医院内MRSA的多态性，为临床合理、有效地使用抗生素和控制耐药基因在种群间的传播提供帮助。方法用MecA基因相关高变区PCR扩增(HVR-PCR)和随机扩增多态性DNA(RAPD)两种方法，对MRSA菌株进行多态性分析。HVR-PCR检测MecA基因相关高变区正相重复序列元件(DRUs)的长度，根据DRUs数目的不同对MRSA分型;RAPD根据电泳图谱中条带的数目及位置，经NTSYS统计软件进行聚类分析，得到遗传树状图，按MRSA菌株之间的相关性进行分型。结果应用HVR-PCR方法可将31株MRSA标本分为7型，分别含有7、8、9、10、11、12和16个DRUs，其中10DRUs型最多\[11/31(35.48%)\]，16DRUs型最少\[1/31(3.23%)\];应用RAPD分型，31株MRSA共分10型，其中以Ⅳ型为主\[10/31(32.26%)\]，其他型分布比较接近。在11株HVR-PCR分型的10DRUs型中RAPD Ⅳ型4株\[4/11(36.36%)\]，RAPD Ⅲ型和RAPD Ⅳ型各2株\[2/11(18.18%)\];10株RAPD Ⅳ型中9DRUs型、10DRUs型各4株\[4/10(40.00%)\]。结论RAPD方法和HVR-PCR方法对MRSA的分型率都比较高，而且这两种方法都比较简单、稳定、可靠、快速，实用性强，具有广阔的应用前景。 【关键词】  耐甲氧西林金黄色葡萄球菌;MecA基因;随机扩增多态性DNA;MecA基因相关高变区PCR扩增 ABSTRACT: ObjectiveTo investigate the polymorphisms of methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) in local hospitals in order to provide evidence for clinical doctors to use the antibiotics rationally and effectively.MethodsWe analyzed the polymorphisms of MRSA with themethods of PCR for mec-associated hypervariable region (HVR-PCR) and random amplifiedpolymorphic DNA (RAPD). MRSA strains typed by HVR-PCR according to the length polymorphisms which decided by the number of direct repeat unit elements (DRUs) of HVR-PCR products; Grouping of MRSA by RAPD was based on the dependability among different MRSA isolates.ResultsTotally 31 MRSA strains typed by HVR-PCR were divided into 7 types which contained 7, 8, 9, 10, 11, 12 and 16 DRUs. MRSA strains with 10 DRUs were most predominant, present in 11/31 cases (35.48%). Among the 31 MRSA strains typed by HVR-PCR, only 1 showed 16 DRUs. There were 10 types classed by RAPD of all MRSA strains.The dominant type was RAPD Ⅳ, present in 10/31 cases (32.26%). The others showed similar distribution.ConclusionRAPD and HVR-PCR methods not also possess a good ability to obtain interpretable results, but also are simple, stable, reliable and rapid. They both have perfect practicality and prospect of extensive application. KEY WORDS: methicillin-resistant Staphylococcus aureus; mecA gene; random amplified polymorphic DNA; PCR for the mec-associated hypervariable region 葡萄球菌的分型方法很多，传统的分型方法包括血清学分型、抗生素分型等，但均无法满足精确辨别的要求。分子生物学技术的出现为这一领域带来了革命。目前，分子分型方法已成为研究细菌耐药性发生及传播的重要手段，常见的有：脉冲场凝胶电泳(pulsed-fiel gel electrophoresis, PFGE)，随机扩增DNA多态性(random amplified polymorphic DNA, RAPD)，mecA基因高变区长度多态性(PCR for the mec-associated hypervariable region, HVR-PCR)，荧光扩增片段长度多态性(fluorescent amplified fragment length polymorphrism, FAFLP)等。这些方法各有特点，应用于耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin-resistant Staphylococcus aureu, MRSA)的分型在国内外均有报道，但这些方法尚未成熟，各地分型标准也不一样，且多采用单一的分型方法。RAPD 和HVR-PCR联合应用于MRSA多态性分型尚未见报道。本实验采用RAPD和HVR-PCR两种方法对MRSA菌株进行分型，了解其多态性分布状况、鉴别菌株之间的相关性，为合理、有效地使用抗生素和控制耐药基因在种群间的传播提供理论基础。 1材料与方法 1.1材料 1.1.1标本来源实验用的31株MRSA标本来源于2007年3月至2007年12月间西安交通大学医学院第一、第二附属医院的住院患者。 1.1.2实验仪器及试剂MicroScan auto Scan-4型全自动细菌鉴定分析;药敏试验纸片购自英国OXOID公司，Mueller-Hinton平板由本实验室自行配置;细菌基因组DNA提取试剂盒(DP302)、PCR试剂2×Taq PCR MasterMix(含染料)、DNA Marker Ⅱ均购自北京TIANGEN生物技术有限公司;溶菌酶(活力单位2000u/mg)、蛋白酶K购自Amrescos生物公司;金黄色葡萄球菌mecA基因PCR检测引物和HVR-PCR、RAPD多态性分析引物，由北京奥科生物技术有限责任公司合成。DNA扩增仪为MJ Research Inc公司的PTC-200 PCR仪;稳压稳流电泳仪为美国Bio-RAD公司产品;ZF紫外分析仪购自上海小源科技有限公司。 1.2方法 1.2.1细菌鉴定用MicroScan auto Scan-4型全自动细菌鉴定分析仪鉴定MRSA，同时用PCR检测mecA基因，凡头孢西丁(FOX，30μg)纸片药敏试验≤19mm的金黄色葡萄球菌，且mecA基因阳性者报甲氧西林耐药，即为MRSA。 1.2.2PCR引物根据GenBank中金黄色葡萄球菌MRSA基因序列选取适用引物：HVR引物序列为，P1：5′-ACTATTCCCTCAGGCGTCC-3′，P2：5′-GGAGTTAATCTACGTCTCATC-3′[1]，RAPD引物序列为，EP007：5′-AGCACGCTGTCAATCATGTA-3′[2]，KAY1：5′-AGCAGCCTGC-3′[2]。 1.2.3细菌DNA的提取按北京TIANGEN公司生产的细菌基因提取试剂盒(DP302)步骤，提取葡萄球菌基因组DNA。 1.2.4MRSA的HVR-PCR分型取经药敏试验和基因检测为MRSA的菌株基因组DNA 1μL作为扩增的模板，加入PCR反应体系：HVR P1和P2引物各1μL(引物浓度10μmol/L)，2×PCR Master 12.5μL(3mmol/L MgCl2、0.5mmol/L dNTP、0.1u/μL Taq DNA聚合酶、20mmol/L Tris-HCl、100mmol/L KCl，含染料)，灭菌去离子水ddH2O 9.5μL，反应总体积为25μL。PCR反应条件：94℃预变性5min;94℃ 60s，56℃ 45s，72℃，60s，35个循环;72℃延伸5min。扩增产物经聚丙烯酰胺凝胶电泳，银染后分析结果。 1.2.5MRSA的RAPD分型取经药敏试验和基因检测为MRSA的菌株基因组DNA 1μL作为扩增的模板，加入PCR反应体系：RAPD引物EP007 1μL(引物浓度10μmol/L)，RAPD引物KAY1 1μL(引物浓度10μmol/L)，2×PCR Master 12.5μL(3mmol/L MgCl2、0.5mmol/L dNTP、0.1u/μL Taq DNA聚合酶、20mmol/L Tris-HCl、100mmol/L KCl，含染料)，灭菌去离子水ddH2O 9.5μL，反应总体积为25μL。PCR反应条件：94℃预变性2min;94℃ 45s，34℃ 45s，72℃，60s，35个循环;72℃延伸5min。扩增产物经15g/L琼脂糖凝胶电泳后，在凝胶成像系统中进行成像分析。 2结果