发布时间：2014-11-18 来源：人大经济论坛

高同型半胱氨酸血症对球囊损伤大鼠颈动脉核转录因子NF_药学专业毕业论文范文                                                作者：徐会圃，刘长梅，冯义柏 【关键词】  ,甲硫氨酸     Effect of homocysteine on expressions of  NFκB and protooncogene in ballooninjured rat carotid arteries 【Abstract】 AIM: To study the effect of homocysteine (Hcy) on the expressions of nuclear factorκB (NFκB) P65 protein and cfos, cjun mRNA in common carotid artery of rats after balloon injury and to explore the possible mechanism by which homocysteine exacerbates neointimal hyperplasia after angioplasty. METHODS:  The expressions of NFκB P65 protein and cfos and cjun mRNA were detected by Western blot and semiquantitative RTPCR respectively in the common carotid artery. RESULTS:  The expressions of NFκB P65 protein and cfos and cjun mRNA were significantly higher in  low  methionine (LM) group（1.12±0.13, 1.40±0.21, 1.43±0.25）（P0.05） and high methionine (HM) group（1.50±0.37, 1.68±0.27, 1.71±0.30）（P0.01）than those in control group（0.64±0.06, 1.10±0.15, 1.00±0.13）. The expressions of NFκB P65 protein and cfos, cjun mRNA were also significant higher in HM group than those in LM group (P0.05). CONCLUSION:  Homocysteine may upregulate the transcription of cfos and cjun mRNA in common carotid artery after balloon angioplasty by NFκB pathway, which may be responsible for neointimal hyperplasia induced by homocysteine after angioplasty. 【Keywords】 methionine; homocysteine; balloon injury; NFkappaB; protooncogenes 【摘要】 目的： 观察高蛋氨酸饮食诱导的高同型半胱氨酸血症对大鼠颈动脉球囊损伤后血管组织NFκBP65蛋白和原癌基因cfos及cjun mRNA表达的影响，探讨同型半胱氨酸在血管球囊损伤后新内膜过度增生中的可能机制. 方法： 采用Western blot及RTPCR方法分别检测血管组织NFκBP65蛋白和cfos及cjun mRNA表达，并做半定量分析. 结果： 低、高蛋氨酸组血管组织NFκBP65蛋白、cfos及cjun mRNA的表达均高于对照组，分别为1.12±0.13 vs 0.64±0.06 （P0.05）, 1.50±0.37 vs 0.64±0.06 (P0.01), 1.40±0.21 vs 1.10±0.15 （P0.05）, 1.43±0.25 vs 1.10±0.15 （P0.01）及1.68±0.27 vs 1.00±0.13 （P0.05）, 1.71±0.30 vs 1.00±0.13 （P0.01）,高蛋氨酸组也明显高于低蛋氨酸组(P0.05). 结论： 同型半胱氨酸有可能通过NFκB通路上调血管内皮损伤后动脉组织原癌基因cfos及cjun mRNA的表达，这可能是其促进血管内皮球囊损伤后新内膜过度增生的机制之一. 【关键词】 甲硫氨酸；同型半胱氨酸；球囊损伤；原癌基因；NFκB   0引言 实验研究和临床观察表明，血中同型半胱氨酸(homocysteine, Hcy)升高可引起动脉粥样硬化和血栓形成［1-2］. 然而其在血管内皮球囊损伤后新内膜增生中的作用及其机制尚不清楚. 我们用高蛋氨酸（methionine）饮食诱导高同型半胱氨酸血症，观察其对血管内皮球囊损伤后血管组织NFκB P65蛋白及原癌基因表达的影响，以探讨Hcy促进血管内皮球囊损伤后新内膜过度增生的可能机制. 1和方法 1.1材料 健康雄性12 wk SD大鼠30只(华中科技大学同济院动物中心提供)，体质量280~320 g，随机分为对照组（C）(给普通饲料)，低蛋氨酸组(LM)(含蛋氨酸12 g/kg饮食),高蛋氨酸组(HM)（含蛋氨酸20 g/kg饮食），每组10只，各组均自由进食. 蛋氨酸(北京中山生物技术有限公司，化学纯，批号： 1903001)，总RNA提取试剂(Trizol)及逆转录试剂盒为Giblo公司产品，TaqDNA聚合酶cfos, cjun及内参βactin上、下游引物为TaKaRa大连宝生物工程有限公司产品；兔抗大鼠NFκB P65多克隆抗体、Western blot检测试剂盒均购自武汉博士德公司. 自制2F球囊导管购自天津乳胶制品厂；PCR扩增仪(美国MJPC150公司)，图像分析仪为上海四星公司产品. 高效液相色谱仪(美国water公司).   1.2方法 1.2.1动物模型建立及标本采集动物喂养4 wk后，体质量(350~400) g,禁食12 h，用30 g/L戊巴比妥钠注射麻醉(30 mg/kg, ip). 沿颈前正中线切开皮肤，在颈前三角区暴露左右颈内、外及颈总动脉，结扎左颈外动脉的远心端，用微动脉夹夹住左颈总动脉的近心端及左颈内动脉，切开左颈外动脉的近心端，然后将自制2F球囊导管自颈外动脉的近心端插入颈总动脉至起始部，球囊注入生理盐水，使其充分扩张致有轻度阻力感，然后回拉球囊使球囊达颈动脉分叉处，重复3次，完成后负压回抽球囊中的生理盐水，取出球囊导管，结扎左颈外动脉. 以右侧颈总动脉作为正常对照，只分离血管但不做球囊损伤. 术后1 h，每只动物心脏采血2 mL,立即3000 r/min离心15 min，-20℃冻存待测. 然后脊椎脱臼法处死动物，并立即取左右颈总动脉液氮冻存备用.   1.2.2血浆同型半胱氨酸及蛋氨酸测定每只动物采血2 mL,置于20 g/L EDTANa2的试管中，混匀，30 min内，标本于4℃用3000 r/min离心15 min，分离出的血浆移入相应的EP管，-20℃冻存，留做血浆Hcy和蛋氨酸检测，血浆Hcy检测按文献［3］的方法稍作改良，采用高效液相色谱仪测定血浆Hcy水平，所用试剂批内变异系数5%,批间变异系数10%. 血浆蛋氨酸测定应用日立83550全自动氨基酸分析仪，采用阳离子交换树脂、分离和茚三酮显色等方法测定.   1.2.3Western blot法检测血管组织NFκBP65蛋白的表达参照博士德公司提供的蛋白提取方法,用缓冲液裂解颈总动脉组织得到组织总蛋白. 以牛血清蛋白作为标准品,根据蛋白定量试剂盒的说明绘制蛋白定量标准曲线,于紫外分光光度计750 nm下测光密度Ａ值,计算蛋白提取液的浓度. 将优化表达的NFκB P65蛋白用100 g/L聚丙烯凝胶电泳分离后电转移至硝酸纤维素膜上,封闭后,先加兔抗鼠NFκB（P65）多克隆抗体（1∶500）,再加辣根过氧化物酶结合的驴抗兔多克隆抗体(1∶500),用化学发光法显影，用图像分析系统测定吸光光度值，NFκB P65蛋白的表达量以光密度的相对比值表示.   1.2.4cfos, cjun mRNA表达的检测① 引物序列如下： cfos上游： 5′TCCCAGAGGAGATGTCTGTG3′,下游： 5′GGCTCCAGCTCTGTGACCAT3′，扩增片段331 bp. Cjun上游： 5′GCCTGCACAGTGAGCCTCCG3′下游： 5′AGTTGGCACCCACTGTTAAC3′ 扩增片段490 bp. βactin上游： 5′CCTAAGGCCAACCGTAAAG3′下游: 5′TCTTCATGGTGCTAGGAGCCA3′,扩增片段623 bp. ② 总RNA抽提和cDNA第一链的合成： 用Trizol试剂抽提左右颈总动脉组织总RNA，各RNA样本A260 nm/A280 nm的比值均在1.8~2.0之间，用逆转录试剂盒合成cDNA第一链. ③ PCR反应条件： 目标基因反应条件如下，94℃预变性2 min，进入PCR循环： 94℃ 30 s, 55℃ 30 s, 72℃ 40 s,共35个循环，结束前72℃延伸7 min;内参反应条件： 94℃预变性2 min, 94℃ 20 s, 62℃ 30 s, 72℃ 30 s;共28个循环，结束前72℃延伸7 min. ④ PCR产物经20 g/L琼脂糖凝胶电泳，EB染色，用生物凝胶电泳图象分析系统对电泳条带进行灰度积分，并以βactin校正.   学处理： 所有数据以x±s表示，组间比较采用方差分析和SNKq，统计处理用SPSS统计软件，P0.05为有统计学意义. 2结果 蛋氨酸组血浆蛋氨酸和同型半胱氨酸浓度均显著高于对照组(P0.01),低、高两组之间也有明显差异（P0.05，表1）. 低及高蛋氨酸组NFκB P65蛋白表达与对照组比较有显著差异（P0.05, P0.01）,低高两组之间差异也有显著性